Determinación de la vitalidad espermática

Dado que los espermatozoides inmóviles pueden estar vivos, solo una coloración supravital de eosina nigrosina puede establecer esa diferencia.

Coloración supravital

Los espermatozoides muertos o en proceso de muerte, poseen sus membranas permeables a los colorantes. Por tal razón se emplea esta propiedad para la determinación de los espermatozoides vivos.

Existen varios métodos de coloración, de los cuales se ejemplificará uno simple

  Coloración con eosina/nigrosina:
   
Preparación de la solución colorante
   
-          Solución de eosina al 2%
      0,2 g eosina
      0,3 g citrato de sodio dihidratado
    10,0 ml agua destilada

Si la coloración con eosina se hace sin nigrosina deberá emplearse un filtro azul o un microscopio con contraste de fase.

Esta coloración puede ser reemplazada por los exámenes de motilidad rectilínea progresiva y morfología espermática. Su uso está indicado particularmente en caso de inexperiencia en las evaluaciones mencionadas. El semen con más de 30% de muertos no es congelable.

Metodología de coloración

Los frotis deben mantenerse en un lugar seco. La humedad deteriora las pruebas!

v    Los colorantes deben mantenerse durante su uso a ≈ 30°C (platina térmica o estufa) para evitar el shock térmico y de esta forma datos falsos

v    Luego de extraído el semen y después de observar la motilidad en masa, se toma una gota, y se la coloca sobre portaobjetos.

v    Se agrega una gota del colorante de eosina, se homogeniza la mezcla con un cubreobjetos, varilla o escarbadientes y luego se agrega una gota de nigrosina.

v    Luego de 1 minuto se realiza el frotis.

v    Se observa, al cabo de 2 min, sin cubreobjetos con aumento 40x o con inmersión 100x

Recuento de células vivas y muertas

v Con microscopio óptico, recorrer el frotis en forma de guarda griega y contar 200 células distribuidas en el preparado.

v  Estimar el porcentaje de vivos (o muertos), a partir de las 200 células contadas. (Si la solución resultara demasiado diluida, repetir la operación aumentando el número de filas)

v Con una muestra de semen descongelado, se podrá esperar 60 a 80% de células vivas: Correlacionar con el porcentaje de móviles al descongelar. Si el semen tiene menos de 40% de movilidad rectilínea progresiva totales y (/o) menos de 40% de "vivas" -cifras equivalentes-, el semen no es recomendable para ser usado en inseminación artificial

v   Los espermatozoides vivos en el momento de la coloración no se teñirán. Los muertos se observarán de color rosado.

Estudios de morfología espermática

Este examen es de suma importancia para determinar la viabilidad de semen para la congelación. Los métodos recomendados por su practicidad son los siguientes:

1. Solución de formol-citrato al 4%

  Formol 4 ml
  Citrato de Na 96ml

Una gota de semen en ≈0,5 ml de solución. Se observa entre porta y cubreobjetos en un microscopio con contraste de fase y con lente de 40x o inmersión de 100x

2. Tinta China

Colocar una gota de semen con 10 de tinta china en un portaobjetos, mezclar y hacer una extensión, secar y examinar. Este es un método útil para la observación de morfología acrosómica.

3. Solución de eosina-nigrosina

Sobre un cubreobjetos se coloca una gota de semen y una gota de la solución de eosina-nigrosina. Luego de 1-2 min se observan espermatozoides rojos y no coloreados, sobre el fondo oscuro. La diferencia de coloración se debe a que los espermatozoides vivos -como tienen su membrana plasmática intacta-, no se colorean. El colorante puede penetra, sin embargo, la membrana de los espermatozoides muertos y los colorea.

espermatozoides coloreados = espermatozoides muertos!

Esquema para la evaluación de la morfología espermática según Leidl y col. (1971, modificado)

En la evaluación del eyaculado es posible encontrar alteraciones de volumen, motilidad y morfología, entre otras. Una clasificación general con nomenclatura diagnóstica permite la clasificación de las alteraciones existentes.

Esquema de la evaluación de la morfología espermática según La Escuela Superior de Medicina Veterinaria (modificado)

© Copyright 2003 - 2007 - reprobiotec.com. Todos los derechos reservados. All rights reserved.
Castor Polux design - www.castorpolux.com.ar